【系列一】IPHASE/匯智和源 體外藥代動力學研究熱點問題解答

體外藥代動力學研究

—熱點問題—

第一題    在代謝穩定性研究中，需要使用肝微粒體和原代肝細胞兩個試驗系統進行試驗嗎？

肝微粒體是肝組織在勻漿和差速離心過程中獲得的由破碎的內質網自我融合形成的近似球形的膜囊泡狀結構，包含了CYP450酶和一些二相酶，如UGTs、ST等。原代肝細胞(Primary hepatocytes)是指從動物肝臟直接分離后立即培養的肝細胞，基本維持了肝臟的代謝功能，特別是較好的保留了與體內一致的酶水平。在代謝穩定性研究中，不需要考慮成本，可同時選擇兩種試驗系統進行試驗；也可根據化合物的代謝特性選擇合適的試驗系統，原則是哪個系統代謝速率高選哪個。一般情況下，化合物分子水溶性較強、一相代謝為主要代謝途徑（尤其是經由CYP）等情況下，肝微粒體為不錯的選擇；二相代謝為主要途徑、水解作用為主要代謝途徑、肝微粒體中非特異性蛋白結合很高、肝微粒體中代謝不明顯的時候，可使用原代肝細胞進行試驗。

第二題    代謝穩定性試驗中微粒體濃度是考察過的嗎?過高或過低有什么影響呢？

在代謝穩定性試驗中，蛋白濃度也會影響代謝速率，通常選擇的微粒體蛋白濃度為0.1mg/mL~1mg/mL，具體選用多大蛋白濃度需根據化合物自身代謝特性去選擇。微粒體蛋白濃度過高，會導致藥物和微粒體蛋白非特異性的結合；而微粒體濃度過低，則可能導致藥物的代謝不明顯。

第三題    非特異性蛋白結合對試驗結果有什么影響？

如果候選藥物與微粒體蛋白發生非特異性結合，則會導致動力學參數的改變。隨著蛋白濃度的增加，Km值也會增大，從而造成推測的內在清除率偏低。同時，候選藥物與微粒體中蛋白的結合，也會造成不同實驗室和不同體系結果差異較大。

第四題    藥物只做一相代謝可代謝10%，只做二相代謝也只代謝10%，但使用二相代謝試劑盒卻可代謝50%，如何解釋？

藥物的生物轉化，分為一相代謝反應和二相代謝反應。藥物在一相代謝反應中主要發生氧化、還原和水解的反應，經過一相代謝反應，藥物可能帶有一些極性基團，如羥基、羧基等。二相代謝，又稱結合反應，一相代謝產物或原型藥物在酶的影響下與內源性小分子發生結合，使藥物毒性、活性降低或極性增加而易于排出的反應。一般來說，藥物先進行一相反應進行轉化，如果極性依然較弱，則會啟動二相反應，但有些藥物可直接進行二相反應。所以，才會有以上現象的存在。

第五題    半衰期和清除率怎么計算？

將受試物在0min濃度作為100%，各時間點的受試物濃度與0min濃度相比得到剩余百分數。各時間點的受試物剩余百分數的自然對數與孵育時間經線性回歸，求得斜率(k)，由公式求得各種屬微粒體中的消除半衰期t1/2和體外肝微粒體中的固有清除率Clint in vitro。

第六題    原代肝細胞代謝穩定性試驗細胞密度推薦多少？清除率計算和肝微粒體一樣的嗎？

原代肝細胞代謝穩定性試驗推薦的細胞密度為0.5~2×106個/mL，清除率計算和肝微粒體代謝穩定性試驗的結果處理方法是一致的。

第七題    代謝穩定性研究試劑盒中陽性底物的作用是什么？孵育時間點應如何設置？

試劑盒中陽性底物的作用主要是為了證實試劑盒的有效性。孵育時間點的設置主要看是基于什么試驗目的，若只是為了驗證孵育系統是否正常工作，僅需設置0點和一個非零時間點即可；若需考察陽性底物的代謝穩定性特征，則需設置0點和3~5個非零時間點。

第八題    肝微粒體試驗中，孵育時是否要開蓋保證有氧氣的參與？

理論上來講，一相代謝反應是有氧反應，需要有氧氣的供應，我們內部曾做過驗證，孵育時開不開蓋對結果沒有影響。

第九題    代謝穩定性試驗中必須要有鎂離子嗎？鎂美離子的作用是什么啊？

代謝穩定性研究可以有肝微粒體和原代肝細胞兩種試驗系統可供選擇。如果使用原代肝細胞為試驗系統不需要添加鎂離子，如果選擇肝微粒為試驗系統則需要添加鎂離子來輔助代謝，鎂離子可以有效的提高酶的活性。

第十題    代謝產物鑒定試驗中孵育時間該如何選擇？

代謝產物鑒定的試驗系統需與代謝穩定性試驗保持一致。如果選用肝微粒體為試驗系統，孵育時間通常控制在60min內(最長不超過2h)；如果選用肝細胞為試驗系統，孵育時間需控制在120min內(最長不超過4h)，在設定的孵育時間內調整肝微粒體的加入量或肝細胞的終濃度，讓藥物的剩余量控制在10%~50%的范圍內，以保證有足量的代謝產物生成而便于進行產物推斷。

十一題    代謝穩定性藥物濃度一般為1μM，代謝產物鑒定一般10μM，這個濃度如果體內遠遠達不到該怎么辦？

在代謝穩定性試驗的目的是得到半衰期和體外清除率的數據，從而推斷體內的清除率。理論上，孵育濃度低至<<Km值時，測得的Clint就基本上不在變化了，而大部分化合物的Km>>1μM，故一般未知化合物都會選1μM進行試驗；代謝產物鑒定試驗提高化合物的濃度的目的是能夠有足量的產物生成而利于產物鑒定。如果體內達不到，可以根據實際情況進行調整。

十二題    一相代謝和二相代謝所用的緩沖液是不一樣的嗎？PBS和Tris緩沖液？

有文獻報導，對于大多數UGT酶亞型，由于PBS緩沖液會降低其選擇性和酶活性，所以二相代謝中選用了Tris緩沖液，故導致了一相代謝和二相代謝所使用的緩沖液有差異。

十三題    如果需要同時考察一相和二相代謝，試驗系統應如何選擇？

如果要同時考察一相和二相代謝，選擇原代肝細胞作為試驗系統是不錯的選擇。原代肝細胞具有完整的細胞結構，不需要額外添加輔助因子，可以很好的模擬體內的代謝情況。

十四題    磷酸鹽緩沖液的目的是什么啊？為什么要磷酸根呢？

磷酸鹽緩沖液的目的是模擬生理環境，磷酸根是維持體內體液環境最重要的緩沖對之一，故選擇了磷酸根。

十五題    0min代謝點總是會發生代謝反應，該如何處理？

建議先加入終止液，再啟動代謝反應。