游離藥物濃度檢測——生物樣本分析前處理技術

關鍵詞：游離藥物濃度，Free Concentration，生物樣本前處理，生物樣品前處理，平衡透析法，equilibrium dialysis（ED），超濾法，Ultra-filtration（UF），快速平衡透析裝置，RED，血漿蛋白結合，Plasma Protein Binding(PPB)

游離藥物濃度（Free Concentration）是指生物樣本（如血漿、血清、組織液等）中未與蛋白質或其他大分子結合的游離態藥物、激素、代謝物或其他小分子分析物的濃度。由于許多生物活性物質在體內會與蛋白質（如白蛋白、α?-酸性糖蛋白、免疫球蛋白等）結合，只有游離部分才能發揮藥理或生理活性，因此測定游離藥物濃度（Free Concentration）在藥代動力學（PK）、藥效學（PD）、臨床監測和生物分析樣本前處理過程中具有重要意義。

一、游離濃度的前處理技術

在生物樣本（如血液、尿液、組織等）中測定游離（未結合）藥物、激素或其他分析物的濃度時，生物樣本前處理步驟需確保目標物質的游離狀態不被破壞，同時去除干擾物質。目前的游離藥物濃度分析生物樣品前處理技術有平衡透析法（equilibrium dialysis，ED）、超濾法（Ultra-filtration，UF）、超速離心法（Ultracentrifugation，UC）、凝膠過濾/尺寸排阻色譜（Size-Exclusion Chromatography, SEC）、固相萃取或免疫親和純化和化學或酶解處理（結合型釋放后檢測），但常用的是平衡透析法（equilibrium dialysis，ED）、超濾法（Ultra-filtration，UF）和超速離心法（Ultracentrifugation，UC），其中平衡透析法更是游離藥物濃度生物樣品前處理技術的金標準。

1.1 平衡透析法

平衡透析法（equilibrium dialysis，ED）是測定生物樣本（如血漿、血清）中游離藥物、激素或代謝物濃度的金標準方法，常用于血漿蛋白結合試驗（Plasma Protein Binding, PPB），其核心原理是利用半透膜使游離小分子在樣本與緩沖液之間達到平衡，而大分子結合物（如蛋白結合型藥物）因無法透過膜被分離。

【試驗步驟】

1、樣本準備：血漿、血清、腦脊液或其它基質

2、透析裝置：不銹鋼特氟龍板平衡透析裝置（HTD）或快速平衡透析裝置（RED）

3、膜選擇：纖維素膜

4、加樣：供體室加入含藥基質，受體室加入PBS

5、孵育：37℃，5% CO2培養箱培養4~24小時，根據裝置決定孵育時間

6、終止與收集：分別從供體室和受體室取一定體積的溶液，用LC-MS/MS、HPLC或免疫分析法檢測濃度。

由上可知，平衡透析法的關鍵步驟在于裝置、膜的選擇、平衡時間的優化等三個方面。IPHASE作為體外研究生物試劑的引-領者，為提供更好的服務，開發了普通平衡透析裝置（HTD）和快速平衡透析裝置（RED）兩種，均配以纖維素膜，以期滿足不同客戶的多種需求。它們在原理上相似，但在實驗設計、操作效率、適用性等方面存在差異，以下為兩者詳細對比：

簡而言之，平衡透析法具有高準確性、適用于低結合率物質（游離濃度＜1%）、無剪切力干擾及可同時處理多個樣本（具有96孔板）等多個優點，但其也同時具備耗時長、樣本需求量大、可能受膜吸附或體積位移影響及緩沖液成分可能影響蛋白結合等多個缺點。因此，客戶需根據具體試驗結合選擇。

1.2 超濾法

超濾法（Ultrafiltration, UF）的核心原理是通過離心力驅動小分子游離分析物通過超濾膜，而大分子蛋白及結合物被截留。以下是超濾法的全面解析，包括原理、步驟、優缺點、優化策略及與平衡透析的對比。

【試驗步驟】

1、樣本類型：血漿或血清

2、樣本預處理：3000×g, 10分鐘，去除細胞碎片或纖維蛋白

3、加樣：將100-200 μL血漿加入超濾離心管

4、離心：37℃ 2000-3000×g, 30分鐘（需優化轉速和時間，避免膜堵塞或結合物解離）

5、收集濾液：取濾液（通常10-50 μL）用于檢測（LC-MS/MS、HPLC等）

作為快速經濟測定游離濃度的方法之一，超濾法具有快速高效、使用樣本量少、及操作簡便等優點，但同樣由于其裝置的影響，超濾法存在著膜吸附、剪切力干擾及高結合藥物靈敏度受限等不可忽視的缺點。因此，客戶可根據自己的試驗需求選擇前處理技術，若需快速篩查或樣本量有限，可優先選擇超濾法；若需高精度數據，則應選擇平衡透析法。

1.3 超速離心法

超速離心法(Ultracentrifugation, UC)是一種基于物理分離的技術，通過極-高的離心力（通常 >100,000×g）將生物樣本中的游離分析物與結合型分析物（如蛋白結合物）分離。該方法適用于血漿、血清、腦脊液等樣本中游離藥物、激素或代謝物的測定。其原理是依據在超高速離心條件下，由于分子大小和密度的差異，大分子（如蛋白質、蛋白結合型分析物）因分子量大、密度高而沉降到管底，而游離的小分子（未結合）則保留在上清液中。

【試驗步驟】

1、樣本類型：血清、血漿、組織樣本

2、離心速度：100,000–150,000×g，速度過低可能導致結合物沉降不完-全

3、離心時間：30min-2小時，時間過長可能導致游離分子吸附或降解

4、溫度：4℃（推薦）或室溫，低溫減少蛋白變性和結合物解離

5、離心管類型：聚碳酸酯或超離心專用管，避免使用易吸附分析物的材質

6、收集濾液：小心吸取上清液（避免擾動沉淀），用于后續分析（如HPLC、LC-MS/MS）；

若需測定結合型分析物，可溶解沉淀（如用緩沖液或有機溶劑）后檢測。

超速離心法(Ultracentrifugation, UC)由于其不引入抗體、吸附劑等物質，具有無外源干擾、適用性強和樣本兼容性強等3種優點，但由于其通過高速離心進行分離，亦存在潛在結合物解離、樣本損傷多及硬件設施不滿足試驗等問題。因此，若實驗條件允許，可結合超濾或平衡透析進行方法驗證，確保數據可靠性。

綜上所述，常見的游離濃度樣本分析前處理技術包括平衡透析法（equilibrium dialysis，ED）、超濾法（Ultra-filtration，UF）和超速離心法（Ultracentrifugation，UC），它們有各自的適用范圍和優缺點。因此，客戶應結合實際情況以選擇合適的方法進行游離濃度的獲取。

二、IPHASE產品

綜上所述，游離濃度的生物樣本分析前處理主要有平衡透析法、超濾法和超速離心法等三種方法，作為體外研究生物試劑引-領者，IPHASE可以給平衡透析前處理提供血漿蛋白結合試驗平衡透析裝置、一次性快速平衡透析板、可重復使用快速平衡透析板、快速平衡透析插件、平衡透析膜、血漿蛋白結合試驗平衡透析裝置封口膜、血漿蛋白結合試驗平衡透析裝置底座、特氟龍板和超濾管等多類產品。

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匯智和源，致力于為創新藥研發企業及生命科學研究機構提供高品質的生物試劑，IPHASE為公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research"。